Действие I
Лес Фонтенбло. Дровосеки жалуются на зиму и непрекращающуюся войну с Испанией. Елизавета, дочь французского короля Генриха II, уверяет их, что скоро наступит мир.
Испанский принц дон Карлос инкогнито приезжает во Францию, чтобы тайком взглянуть на французскую принцессу, на которой он должен жениться для заключения мира между воюющими странами. Елизавета и Карлос встречаются в лесу и влюбляются друг в друга. Они ещё не знают, что Филипп II, отец Карлоса, решил сам жениться на юной Елизавете. Народ празднует окончание войны, а Елизавете ничего не остаётся, кроме как смириться со своей неожиданной судьбой. Дон Карлос в смятении.
Действие II
Карлос отправляется в монастырь св. Юста, чтобы поразмышлять у гробницы короля Карла V, своего деда. Ему кажется, что он слышит из уст одного из монахов голос покойного короля. Карлос не в силах смириться с потерей возлюбленной и рассказывает об этом своему другу детства, маркизу Родриго ди Поза, который только что вернулся из Фландрии, страдающей под испанским владычеством. Родриго убеждает Карлоса удалиться от двора и вместе с ним бороться за независимость Фландрии.
Гробницу Карла V посещают король и королева. Фрейлины Елизаветы и принцесса Эболи тем временем отдыхают в саду у ворот монастыря.
Родриго уговаривает Елизавету принять Карлоса в надежде, что королева сможет убедить короля отпустить сына во Фландрию. Встреча возрождает пылкие чувства влюблённых, однако Елизавета напоминает Карлосу, что теперь она ему как мать. Вскоре после ухода Карлоса прибывает король. Он видит, что, вопреки придворному этикету, королева одна, и наказывает за это её компаньонку, приказав ей покинуть двор, затем велит всем придворным удалиться. Родриго, оставшись наедине с королём, пользуется этой возможностью, чтобы напомнить монарху о бедственном положении Фландрии. Родриго симпатичен королю своим свободолюбием и независимостью, и Филипп осторожно высказывает ему свои сомнения по поводу отношений между королевой и своим сыном. Он также советует Родриго остерегаться Инквизиции.
Действие III
Бал в честь коронации Филиппа. Елизавета не хочет присутствовать и меняется одеждой с принцессой Эболи, чтобы незаметно уйти. Принцесса же, тайно влюблённая в Карлоса, назначает ему встречу в королевском саду. Карлос, полагая, что перед ним Елизавета, осыпает её страстными признаниями, которые Эболи принимает на свой счёт. Поняв же, что Карлос любит королеву, одержимая ревностью принцесса угрожает раскрыть их тайну. Слышавший этот разговор Родриго вмешивается и прямо угрожает Эболи. Осознавая грозящую опасность, Родриго убеждает Карлоса передать ему все имеющиеся у того компрометирующие документы.
Народ славит короля, монахи и Инквизиция призывают на головы еретиков проклятие и готовят аутодафе. Карлос во главе депутации от Брабанта и Фландрии нарушает все придворные протоколы и, не предупредив Родриго, умоляет короля выслушать его мольбу. Разгневанный Филипп обвиняет Карлоса и депутатов в измене. Карлос обнажает шпагу в присутствии отца. Никто не смеет вмешаться, и Родриго, стремясь избежать самого худшего, разоружает Карлоса. Карлос, в свою очередь, поражён тем, что, как он считает, друг предал его. Филипп объявляет, что присваивает Родриго титул герцога. Церемония заканчивается казнью еретиков.
Действие IV
Ревнивый король в одиночестве своего кабинета угрюмо размышляет о том, что Елизавета его не любит, а сын ослушался его. Не в силах приговорить сына к смерти, король вызывает к себе Великого Инквизитора, чтобы посоветоваться с ним. Тот отвечает, что Господь пожертвовал Своим сыном и требует отдать ему Родриго, обвинив того в распространении опасных и еретических идей. Король резко возражает и отказывается отдавать своего нового неожиданного друга.
Вбегает королева и требует у мужа правосудия: у неё похитили шкатулку с драгоценностями. К её изумлению, шкатулка оказывается у Филиппа. Король открывает шкатулку и показывает Елизавете хранящийся там портрет Карлоса, который тот подарил ей в лесу Фонтенбло. Филипп обвиняет жену в измене, королева падает в обморок.
Принцесса Эболи терзается раскаянием и рассказывает королеве, что она хотела оклеветать её и поэтому похитила шкатулку. Она признаётся, что влюблена в Карлоса, а также в том, что была любовницей короля. Елизавета предлагает ей выбор: изгнание или монастырь.
Родриго приходит в темницу к Карлосу и говорит, что его скоро освободят. Он также сообщает, что у него нашли компрометирующие документы, которые Карлос передал ему. К ним Родриго прибавил и другие, которые станут несомненным доказательством того, что во всём виноват он один. Раздаётся выстрел. Смертельно раненный Родриго падает. Он едва успевает сказать Карлосу, что Елизавета будет ждать его завтра утром в монастыре св. Юста.
Приходит Филипп, чтобы освободить Карлоса и признать свою ошибку. Увидев, что Родриго погиб, король горько оплакивает человека, ставшего его другом и избавившего его от одиночества. Он хочет помириться с сыном, но Карлос отвергает его и просит душу Родриго наставить его в сражении за свободу Фландрии.
Народ, подстрекаемый Эболи, штурмует темницу, чтобы освободить Карлоса. Однако появление Великого Инквизитора вселяет во всех ужас, и люди склоняются перед Богом и королём.
Действие V
Елизавета, вне себя от горя, молится у гробницы Карла V и просит даровать ей покой в смерти. Карлос уезжает во Фландрию и приходит проститься с ней. Их последнее горестное прощание прерывают король с Великим Инквизитором. Инквизитор обвиняет Карлоса в измене и приказывает схватить его, но таинственный монах уводит принца в глубь монастыря. Король и Великий Инквизитор поражённо застывают на месте, также услышав голос Карла V.
